30 Stappen om samples gereed te maken voor LC-MS analyse

1. Snij de gel in kleine stukjes (n.b. presteren onder schone omstandigheden in de kast met laminaire stroming of weefselkweekkap)
2. Was de gel blokjes met 250µl MilliQ.
3. Na het verwijderen van het MilliQ, voeg je 100% ACN toe om de gel stukjes te bedekken.
4. Vortex (check of de gel stukjes zijn gezonken).
5. Verwijder de ACN.
6. Voeg 100µl verse DTT toe om de proteïne/eiwit te reduceren (oplossing moet de gel stukjes bedekken).
7. Laat het schudden voor ongeveer 1 uur op 60 graden.
8. Verwijder de DTT en breng de monsters naar kamer temperatuur.
9. Voeg 100% ACN om de gel stukjes te bedekken.
10. Vortex (check of de gel stukjes zijn gezonken).
11. Verwijder de ACN.
12. Voeg 100µl verse IAA.
13. Laat de gel stukjes op kamer temperatuur in het donker voor 20-30 minuten.
14. Verwijder de IAA en voeg 100µl van 100% ACN toe om de gel stukjes te bedekken.
15. Vortex (check of de gel stukjes zijn gezonken).
16. Verwijder de ACN.
17. Voeg 100µl toe (genoeg om de gel stukjes te bedekken) AmBic.
18. Vortex; verwijder AmBic wanneer de gel stukjes zijn gezwollen (dit kan 15 minuten duren).
19. Voeg 100µl van 100% ACN om de gel stukjes te bedekken.
20. Herhaal stap 15 tot 19.
21. Vortex, check of de gel stukjes zijn gezonken en verwijder de ACN.
22. Maak een 30keer verdunning van voorraad trypsine in ijs koud AmBic (= 3 ng/µL, trypsine) en voeg 20µL (of meer indien mogelijk) om de gel stukjes te bedekken.
23. Laat de monsters op ijs voor circa 90 minuten (minstens 30 minuten).
24. Verwijder overtollige trypsine en voeg 20µL (of meer) AmBic om de gel stukjes te bedekken.
25. Incubeer 's nachts of voor te minste 4 uur @ 37 graden.
26. Breng de eerste supernatant in een nieuw flesje.
27. Voeg 100µL 100% ACN of 20uL (of meer, genoeg om de gel stukjes te bedekken) van 10% FA naar de gel stukjes (=extractie).
28. Vortex, laat 15 minuten in kamer temperatuur en vortex opnieuw.
29. Verwijder de tweede supernatant en voeg het bij de eerste supernatant.
30. Droog de supernatant op in de Speedvac/centrifugale verdamper (als ACN was gebruikt voor de extractie).

Je samples zijn nu gereed voor LC-MS analyse.

Benodigde stoffen + 

Info eigenschappen

pH: Een schaal die het vermogen waterstof aangeeft in een stof. Voor deze geld hoe lager het pH getal hoe zuurder en hoe hoger het pH getal hoe basischer/meer alkaline.

AmBic/Ammoniumwaterstofcarbonaat(NH₄HCO₃): Wanneer de stof tussen temperaturen bevindt tussen 36 en 60 graden dan komt er een chemische reactie NH₄HCO₃ → NH₃ + H₂O + CO₂. Deze stof wordt ook gebruikt voor blusmiddelen, medicijnen, kleurstoffen, kunststof, keramiek, leerlooierij en katalysatoren.

Dichtheid: 1,586 g / cm3

Kookpunt: 169,8° C

Smeltpunt: 41,9 ° C

ACN/Acetonitrile(C₂H₃N): Dit is een middel die vaak als oplosmiddel wordt gebruikt. Het is een kleurloze vloeistof. ACN is heel droog en kan vloeistoffen onttrekken.

Dichtheid: 0,7 g / cm3

Kookpunt: 82 ° C

Smeltpunt: −45 ° C

DTT/Dithiothreitol(C₄H₁₀O₂S₂): Deze stof is om gethioleerd DNA te reduceren. Zo kan DTT disulfidebindingen van eiwitten afbreken en peptiden allen negetief laten opladen.

Dichtheid: 1,3 g / cm3

Kookpunt: 125-130°C

Smeltpunt: 41-44 ° C

IAA/Iodoacetamide(C₂H₄INO): Deze stof is geelbruin en in ook dodelijk voor mensen. Je kan hiermee het in kaart brengen van peptiden.

Dichtheid: 2,3 g / cm3

Kookpunt: 297,1 ± 23,0 ° C

Smeltpunt: 92-95 ° C

HCI/Waterstofchloride: Deze stof dingen waarmee hij in aanraking komt weg smelten. Deze stof ontstaat ook in de maag door cellen. Het helpt bij het verteren van vetten en eiwitten.

Dichtheid: 0,00149 g / cm3

Kookpunt: -84,9 ° C

Smeltpunt: −114,8 °C

Peptiden: Een bestaat uit een aantal aminozuren. Het kan een bouwsteen vormen voor eiwitten.